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ELISA試驗常見問題
A1、ELISA試驗出現非常弱的結果，常見有7種原因，其解決方法如下：1)可能原因：溫育的時間或者溫度不夠；解決方法：校正溫育箱溫度。2)可能原因：顯色反應時間太短；解決方法：校正定時鐘準確定時。3)可能原因：所用配制緩沖液的蒸餾水有問題；解決方法：使用新鮮合格的蒸餾水。4)可能原因：加入抗體/酶的稀釋液濃度太低；解決方法：按照說明書保存試劑盒和準確配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時要緊密。5)可能原因：酶標儀濾光片不正確；解決方法：檢查酶標儀使用的濾光片。6)可能原因：試劑盒沒有充分平衡；解決方法：試劑室溫平衡至少120分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫。7)可能原因：不正確的試劑儲存方式；解決方法：按照說明書要求保存試劑盒。2、試驗結果白板，而且陽性對照不顯色，應如何分析和查找原因?答：試驗結果白板，而且陽性對照不顯色，常見原因如下：a)可能原因：漏加或者誤加試劑；解決方法：檢查試驗記錄和剩余試劑。每次加液前均應核對標簽。b)可能原因：試劑過期；解決方法：使用有效期內的產品。c)可能原因：洗板液配制中出現問題，如量筒不干凈含HRP酶抑制物(疊氮鈉等);解決方法：使用干凈的器皿，正確配制試劑。d)可能原因：溫育的時間或溫度不夠；解決方法：校正溫育箱溫度。e)可能原因：標準品失活或者丟失；解決方法：標準品正確保存、溶解和混勻。f)可能原因：抗體失活或者丟失；解決方法：更換抗體或者提高抗體濃度。g)可能原因：酶失活或者丟失檢查方法：把工作濃度的酶再稀釋20-100倍，取5uL加入100ul的顯色液A和B混合底物，終止后顯色是否能達到1.0左右，此為酶的粗略估計。解決方法：更換酶或者提高酶的濃度。h)可能原因：顯色底物失活檢查方法：加少量的工作濃度的酶，TMB是否很快顯色。解決辦法：更換顯色底物。3、試驗結果空白背景高，這是什么原因造成的?答：試驗結果空白背景高，常見原因如下：a)可能原因：洗板不干凈；解決方法：充分洗滌，徹底拍干；洗板要防止交叉污染；濃縮洗液準確配制；吸嘴盡可能一次性使用；加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用，不要反復使用，否則易造成污染。b)可能原因：顯色液變質或者試劑過期；解決方法：檢查試劑盒有效期。c)可能原因：蒸餾水受酶等污染；解決方法：使用新鮮蒸餾水；d)可能原因：試劑混用；解決方法：不同批號試劑勿混用。e)可能原因：培養箱溫度超過37℃或反應
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做ELISA實驗需要注意哪些問題?
A1、ELISA操作前準備工作試劑盒的選擇ELISA操作前，應做好實驗的設計、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒、提前訂購和準備試劑及耗材、處理樣本等準備工作。樣本處理在收集標本前需有一個完整的計劃，需要清楚要檢測的成份是否足夠穩定。ELISA檢測提倡新鮮標本盡早檢測，對收集后當天就進行檢測的標本，及時儲存在4℃備用，如有特殊原因需要周期收集標本，請取材后，將標本及時分裝后放在-20℃或-80℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實驗質量，所以避免反復凍融。2、ELISA標準品稀釋標準品嚴禁反復凍融。標準品的倍比稀釋應事先做好準備，如離心管的準備和編號以及稀釋液的準備；稀釋時，應充分混勻；采用進口或者硅化的EP管，減少蛋白吸附。在實驗孔內進行倍比稀釋時，注意操作規范，槍頭勿刮劃預包被的孔底。注意：睿信品牌試劑盒標準品是已倍比稀釋好的，是即用型標準品。3、ELISA操作中的洗滌洗滌是ELISA實驗中是最多次數的操作，也是非常重要的步驟。不嚴格的洗滌容易出現洗不干凈或交叉污染現象，實驗重復效果差的現象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管，還是洗板機，嚴格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時間和洗滌次數。注意標準化操作將減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。操作者常出現洗板不干凈現象，請比照“手工洗板小貼士”操作：a)洗液不要溢出孔外，以免污染相鄰的孔，特別是每次洗板的前兩遍，若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定會增高。b)特別注意：設計實驗的時候要考慮實驗孔的位置，保證甩掉洗液時，空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側或分開最好。同時注意甩掉洗液的動作翻轉(從正上方旋轉120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉來甩液體!甩出后以直線方式補2-3次甩出液體。c)用干凈的濾紙，不要用衛生紙，因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底，導致洗板不干凈，結果偏高或偏低，重復孔的數值也會相差很大。d)每次拍板不要重復在一個地方拍，特別是洗去酶的步驟；拍板不宜過輕，否則拍不干凈，拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重，以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下，最后一次一定要扣干凈。e)不能減少洗液體積、洗板時間和次數。洗板時間太短，洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數可以使
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ELISA實驗步驟
A1、固相載體選擇聚苯乙烯：具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。聚氯乙烯：聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。2、包被①板孔的選擇：ELISA級別的微孔板；②抗體選擇：選擇支持ELISA實驗的抗體，根據推薦濃度稀釋或摸索最適濃度；③包被緩沖液：pH7.2磷酸鹽緩沖液；④包被溫度：2-8℃過夜包被或室溫(37℃)包被2h;⑤包被濃度：包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化。一般包被濃度為1ug/ml-2ug/ml3、封閉①包被之后一定要立即封閉(封閉非特異性抗體);②選擇效果較好的封閉劑(細胞培養級BSA、Tween等)。4、加樣及孵育①加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡；②孵育的時間及溫度參考試劑盒說明書。如有條件，建議加樣孵育時使用shaker震蕩儀，推薦軌道直徑3mm,轉速在500±50rpm;③檢測抗體、酶標物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時間嚴格根據說明書提示；④洗板對于ELISA來說，是極其關鍵的一步，保證ELISA的特異性；⑤封板膜一定要一次一換，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。5、顯色和終止①使用前需檢查，底物在加入96孔板之前應為無色透明；②顯色底物需現配現用，避免污染；③孵育時間，說明書上為參考范圍，具體需要根據實驗條件自行摸索�？蓞⒖紭饲鷿舛茸畲罂椎念伾�，變為藍色較明顯時即可。
